糖基化的新角色：如何在子宮內膜中為胚胎著床鋪路？

【研究背景】

胚胎植入是懷孕的關鍵步驟，發生在子宮內膜處于“植入窗口期"時，此時子宮內膜對胚胎具有最高的接受性。這一過程受卵巢類固醇激素（雌二醇和孕酮）的調控。然而，不孕問題影響了眾多夫婦，盡管體外受精-胚胎移植技術已經發展，但成功率仍然只有大約30%，失敗的原因主要與胚胎植入有關。因此，深入理解胚胎植入的分子機制對于提高不孕治療的成功率至關重要。糖基化作為蛋白質的一種重要翻譯后修飾，其在細胞間相互作用中發揮關鍵作用，尤其是在胚胎植入過程中，特定的糖鏈結構可能與胚胎與子宮內膜的相互識別和附著密切相關。

【研究結果】

1. STs和FUTs在人月經周期子宮內膜中的表達

為了闡明人子宮內膜中STs和FUTs基因家族在月經周期中的變化，從基因表達綜合庫（GEO）下載的兩個獨立的微陣列數據集（GSE4888和GSE6364）。GSE4888含有增殖期（PE）、早期分泌期（ESE）、中期分泌期（MSE）和晚期分泌期（LSE）子宮內膜。GSE6364含有PE、ESE和MSE子宮內膜。對兩個數據集的分析一致地顯示，8個糖極化相關基因（FUT2、FUT4、FUT8、ST3GAL1、ST3GAL6、ST6GAL1、ST6GAL2、ST6GALNAC1）在整個月經周期中發生變化。與PE相比，MSE中FUT2、FUT4、ST3GAL1、ST3GAL6、ST6GAL1和ST6GALNAC1顯著增加，而與PE相比，MSE中FUT8和ST6GAL2顯著降低。

為了進一步明確這些糖基化基因在人類子宮內膜組織中的表達情況，我們從GSO數據庫下載GSE111976數據集（scRNA-Seq），展示了七種子宮內膜細胞類型。顯示了上皮細胞（CDH1和EPCAM）、基質成纖維細胞（COL1A1和COL3A1）和內皮細胞（PECAM1和CD34）的代表性生物標志物。結果顯示FUT2、ST3GAL6和ST6GALNAC1在子宮內膜上皮中高度表達。本研究主要關注上皮細胞與胚胎的貼壁，并對ST6GALNAC1是否調控分泌期子宮上皮細胞的接受功能進行了研究。

2. ST6GALNAC1和sTn在人子宮內膜中的表達

為了驗證生物信息學分析結果，進行免疫組織化學染色檢測人子宮內膜組織中的ST6GALNAC1表達，主要定位于人子宮內膜的腔上皮（LE）和腺上皮（GE）中。我們還發現sTn在分泌期的人子宮內膜的LE和GE中深度濃縮。同時，定量分析結果顯示分泌期子宮內膜中ST6GALNAC1和sTn水平顯著高于增殖期。

通過一系列實驗揭示了P4在人子宮內膜細胞中通過PR-A上調ST6GALNAC1表達的機制。首先，通過模擬月經周期中增殖期（E2，雌二醇）和分泌期（E2+P4，P4即孕酮）的內部環境，發現E2單獨處理對ST6GALNAC1轉錄物水平無顯著影響，而E2聯合P4處理顯著上調其表達。接著，通過構建PR-A和PR-B質粒并轉染細胞，發現只有PR-A轉染的細胞在P4處理后ST6GALNAC1轉錄物水平顯著增加，表明PR-A參與調控ST6GALNAC1表達。進一步通過siRNA驗證，發現PR siRNA顯著減弱P4/PR-A介導的ST6GALNAC1表達，而PR-B siRNA無影響，進一步證實PR-A的作用。最后，通過ChIP實驗，發現P4處理后PR與ST6GALNAC1啟動子中的PRE結合，啟動其表達。綜上所述，這些實驗結果表明P4通過PR-A直接調控ST6GALNAC1在人子宮內膜細胞中的表達。

3. ST6GALNAC1過表達升高sTn促進AN3CA細胞的感受性

進一步探討ST6GALNAC1過表達對AN3CA細胞感受性的影響。首先，利用慢病毒介導的ST6GALNAC1過表達細胞（LV-ST6OE），發現與對照組（LV-NC）相比，LV-ST6OE細胞中sTn水平升高。接著，通過體外植入模型實驗，發現LV-ST6OE細胞對JAR-球狀體的接受潛力比載體轉染細胞增加了2.5倍。進一步實驗中，用特異性抗體阻斷LV-ST6OE細胞中的sTn，發現這種增強的感受性顯著減弱，而載體組中sTn抗體處理未見顯著變化，可能與AN3CA細胞中sTn含量低有關。綜上所述，這些實驗結果表明，ST6GALNAC1過表達通過升高sTn水平，顯著增強了AN3CA細胞對JAR-球狀體的接受潛力。

4. 人子宮內膜細胞sTn修飾糖蛋白的鑒定

為了揭示ST6GALNAC1在人子宮內膜細胞中通過sTn修飾整合素b1和CD44，進而影響上皮-胚胎附著的機制。首先，通過免疫沉淀（IP）和LC-MS/MS分析，從ST6GALNAC1過表達的AN3CA細胞中鑒定出60種蛋白質，其中18種為分泌蛋白或細胞膜蛋白。重點關注了兩種粘附分子——整合素b1和CD44，因為它們對上皮-胚胎相互作用至關重要且已被報告為sTn攜帶者。接著，通過qPCR和Western blot驗證發現，ST6GALNAC1過表達顯著下調整合素b1的轉錄和蛋白水平，而對CD44的轉錄和蛋白水平無顯著影響。然而，免疫沉淀和反向IP實驗顯示，ST6GALNAC1過表達顯著增加了整合素b1和CD44的sTn修飾水平。此外，微陣列數據分析表明，CD44在窗口期（WOI）的表達顯著增強，而整合素b1的表達直到分泌晚期才發生變化。綜上所述，這些實驗結果表明ST6GALNAC1通過sTn修飾整合素b1和CD44，可能在上皮-胚胎粘附過程中發揮重要作用，其中sTn修飾的CD44可能在窗口期對上皮-胚胎粘附尤為重要。

5. 子宮內膜sTn修飾的CD44與滋養層細胞Siglec-6結合

深入探討滋養層細胞中Siglec-6與子宮內膜sTn修飾的CD44之間的相互作用及其在胚胎著床中的作用。首先，通過分析已發表的單細胞RNA測序（scRNA-Seq）數據集，發現SIGLEC6在極性滋養外胚層（pTE）細胞中與多個標志物基因（如CCR7、CYP19A1和DLX5）共表達，這些細胞負責與子宮內膜上皮直接接觸。進一步的細胞命運軌跡分析也顯示SIGLEC6在滋養外胚層（TE）中表達。接著，利用永生化的正常人滋養層HTR-8/SVneo細胞模型，通過慢病毒系統過表達Siglec-6，并驗證其轉錄和蛋白水平的表達。體外植入實驗表明，Siglec-6過表達的滋養層細胞球狀體對ST6GALNAC1過表達的子宮內膜細胞單層的粘附率顯著增加。最后，通過蛋白質-蛋白質相互作用下拉實驗，發現Siglec-6能夠特異性結合子宮內膜中sTn修飾的CD44。綜上所述，這些實驗結果表明滋養層細胞中的Siglec-6可能通過與子宮內膜sTn修飾的CD44相互作用，在胚胎著床過程中發揮重要作用。

6. sTn/Siglec-G軸與小鼠胚胎著床

為了進一步驗證了sTn/Siglec-G軸在小鼠胚胎著床中的作用。本研究通過一系列體內和體外實驗，首先，通過收集非妊娠（NP）和妊娠第4天（GD4）的小鼠子宮內膜，發現與NP組相比，GD4組中ST6GALNAC1和sTn水平顯著上調。接著，建立小鼠上皮子宮內膜類器官（EEO），發現E2上調Lcn2和Ltf的表達，E2加P4上調Sox17和ST6GALNAC1的表達，表明P4驅動ST6GALNAC1在鼠子宮內膜上皮細胞中的表達。免疫熒光染色顯示，ST6GALNAC1和sTn在GD4時在腔上皮上高度表達。進一步實驗中，在GD2將ST6GALNAC1 siRNA注射到小鼠子宮角中，發現ST6GALNAC1的敲低顯著損害胚胎植入。同樣，在GD3將抗sTn抗體注射到鼠子宮角中，發現阻斷sTn顯著抑制小鼠胚胎著床。鑒于小鼠不表達Siglec-6，通過公共數據庫分析發現Siglec1、Siglecf和Siglecf在小鼠胚胎中表達，其中Siglecf在E3.5時表達水平較高。實驗顯示，Siglec-G在E3.5的小鼠胚胎中表達，且注射抗Siglec-G抗體顯著抑制小鼠胚胎植入。最后，通過免疫沉淀和蛋白質相互作用測定，證實GD4時子宮內膜組織中的CD44含有sTn結構，并且CD44與重組小鼠Siglec-G相互作用，抗Tn抗體可抑制這種相互作用。綜上所述，這些實驗結果表明sTn/Siglec-G軸在小鼠胚胎著床中發揮重要作用，為理解胚胎-子宮內膜相互作用提供了新的機制見解。

【研究結論】

ST6GALNAC1通過調節子宮內膜中sTn的修飾，特別是在CD44上，促進了胚胎與子宮內膜的附著。人類的Siglec-6和小鼠的Siglec-G在胚胎滋養層中表達，并與sTn修飾的CD44結合，從而促進胚胎附著。這一發現揭示了胚胎植入過程中一個新的糖基化依賴機制，不僅增進了我們對糖基化生物學的理解，還為生殖醫學中的診斷和治療策略提供了新的可能性。

Dong X, Wang H, Cai J, Wang Y, Chai D, Sun Z, Chen J, Li M, Xiao T, Shan C, Zhang JV, Yu M. ST6GALNAC1-mediated sialylation in uterine endometrial epithelium facilitates the epithelium-embryo attachment. J Adv Res. 2025 Jun;72:197-212. doi: 10.1016/j.jare.2024.07.021. Epub 2024 Aug 5. PMID: 39111624.