基因型鑒定實(shí)驗(yàn)

一、基因型鑒定實(shí)驗(yàn)技術(shù)定義與核心目標(biāo)

動(dòng)物基因型鑒定是通過(guò)分子生物學(xué)手段檢測(cè)個(gè)體特定基因位點(diǎn)的遺傳組成（如野生型、突變型、轉(zhuǎn)基因插入狀態(tài)），以確定其遺傳特征的技術(shù)。核心目標(biāo)包括：

1. 確認(rèn)基因修飾類(lèi)型：區(qū)分轉(zhuǎn)基因、基因敲除/敲入、點(diǎn)突變等模型。

2. 鑒定遺傳狀態(tài)：判定純合子（-/-）、雜合子（+/-）或野生型（+/+）。

3. 評(píng)估表達(dá)水平：驗(yàn)證目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白表達(dá)是否與預(yù)期一致。

生物學(xué)意義：為遺傳育種、疾病模型構(gòu)建及功能研究提供分子層面的精準(zhǔn)依據(jù)。

二、基因型鑒定實(shí)驗(yàn)核心鑒定方法及技術(shù)流程

1. PCR + 凝膠電泳（主流方法）

• 原理：針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增基因組DNA中的差異片段，通過(guò)電泳條帶大小判斷基因型（圖1）。
  關(guān)鍵引物設(shè)計(jì)策略：

  模型類(lèi)型	引物設(shè)計(jì)	檢測(cè)目標(biāo)
  基因敲除（KO）	野生型引物：位于敲除序列內(nèi)；突變型引物：位于同源臂外或抗性基因內(nèi)（如Neo）	區(qū)分純合/雜合/野生
  基因敲入（KI）	引物跨過(guò)插入位點(diǎn)，擴(kuò)增片段大小差異需>100bp	確認(rèn)外源序列整合位置
  轉(zhuǎn)基因插入	引物結(jié)合外源基因（如GFP），需設(shè)置內(nèi)參引物（如β-actin）	檢測(cè)隨機(jī)插入是否存在

• 流程（以小鼠為例）：

• 瓊脂糖凝膠（1.5-2%）電泳，對(duì)比Marker判斷條帶大小（圖2）。

• 結(jié)果判讀：

• 野生型（+/+）：僅野生條帶（如500bp）。

• 雜合子（+/-）：野生+突變條帶（500bp + 700bp）。

• 純合子（-/-）：僅突變條帶（700bp）。

• 反應(yīng)體系：模板DNA + 特異性引物 + dNTPs + Taq酶。

• 程序：95℃變性→55-60℃退火→72℃延伸（30-35循環(huán)）。

1. DNA提取：剪尾/采血→蛋白酶K消化→酚氯仿抽提。

2. PCR擴(kuò)增：

3. 電泳分析：

! PCR電泳結(jié)果示意圖（野生型、雜合子、純合子）

2. Southern Blot（金標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證）

• 原理：基因組DNA酶切→電泳分離→轉(zhuǎn)膜→標(biāo)記探針雜交，檢測(cè)基因拷貝數(shù)及整合完整性。

• 適用場(chǎng)景：

• 驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)及是否重排/缺失（PCR無(wú)法檢測(cè)）。

• 鑒定隨機(jī)插入位點(diǎn)（需結(jié)合FISH技術(shù)）。

• 局限性：耗時(shí)長(zhǎng)（>3天）、需大量DNA（>10μg）、技術(shù)門(mén)檻高。

3. 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）

• 功能：

• 快速定量轉(zhuǎn)基因mRNA表達(dá)水平。

• 輔助判斷基因敲除效率（目標(biāo)基因表達(dá)量顯著降低）。

• 優(yōu)勢(shì)：靈敏度高、可自動(dòng)化。

4. 熒光原位雜交（FISH）

• 應(yīng)用：

• 直接觀察轉(zhuǎn)基因在染色體上的整合位置。

• 檢測(cè)染色體重排或局部缺失（如CRISPR脫靶效應(yīng)）。

三、基因編輯動(dòng)物模型的特殊鑒定策略

CRISPR/Cas9模型（如囊性纖維化豬）

1. 細(xì)胞階段鑒定：

• 電轉(zhuǎn)遞送CRISPR組件至原代細(xì)胞→G418篩選陽(yáng)性克隆→PCR+Sanger測(cè)序驗(yàn)證編輯效率。

2. 胚胎/個(gè)體鑒定：

• 核移植后電融合形成囊胚→移植至代孕母體→出生后剪尾PCR+測(cè)序。

• 關(guān)鍵指標(biāo)：目標(biāo)基因編輯效率、脫靶效應(yīng)檢測(cè)。

胚胎干細(xì)胞系構(gòu)建（如內(nèi)源標(biāo)簽融合）

• 流程：

• 電轉(zhuǎn)Cas9/sgRNA + 同源重組載體至干細(xì)胞（如Flip08細(xì)胞）。

• 藥物篩選（G418）→單克隆擴(kuò)增→PCR+測(cè)序驗(yàn)證標(biāo)簽整合位點(diǎn)。