人外周血PBMC的CD4+ T細(xì)胞磁珠分選及流式鑒定

一、 人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離

1. 3ml抗凝血加入3ml 1×PBS進(jìn)行稀釋。

2. 在15ml離心管內(nèi)加入3ml淋巴細(xì)胞分離液，再在液面上方平鋪3ml稀釋過的抗凝血，常溫下，水平離心機(jī)600g，離心30min。

3. 吸取中間白膜層細(xì)胞，加入15ml離心管中，再加入10ml 1×PBS混勻，常溫下，1000rpm，離心10min，棄上清，每管加入2ml MACS緩沖液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)樣本不超過107個(gè)細(xì)胞。

4. 2000rpm，離心3min，棄上清。

二、 磁珠分選

1. 每管加入40ul MACS緩沖液重懸細(xì)胞，再加入10ul CD4+T Cell Biotin-Antibody Cocktail, human，混勻，4℃孵育5min。

2. 每管加入30ul MACS緩沖液，再加入20ul CD4+T Cell MicroBead Cocktail,human，混勻，4℃孵育10min。

3. 將分選柱置于磁力架上，加入3ml MACS緩沖液潤洗柱子，待液體不再流出，更換新的離心管。

4. 將細(xì)胞懸液加入分選柱，待液體不再流出，加入3ml MACS緩沖液洗柱子，液體收集完畢，將離心管撤離后，再將分選柱撤下。

5. 將收集到的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，1500rpm，5min，去上清。

三、流式鑒定